为了同时检测同一样本上或同一细胞内是否存在两个或多个目标核酸序列。可以应用双重或多重原位杂交技术。即，两个或更多个标记探针与靶核酸杂交。然后使用不同的检测方法来显示各种目标核酸的存在和分布。该技术类似于免疫组织化学中的双重或多重标记。除了探针本身的特异性外，对结果的干扰主要来自标记与检测试剂之间的相互作用。
(1)放射性核素与非放射性标记探针双标记原位杂交
非放射性标记原位杂交技术的兴起和发展为双标记原位杂交提供了有效的技术途径。在将放射性核素和非放射性物质标记的两种探针组合在一起的双标记原位杂交技术中，常用的放射性核素标记为35S，常用的非放射性标记为生物素和地高辛。这种双原位杂交技术可分为一步法和两步法。在一步法中，用两种探针的混合物一次性完成原位杂交反应。当显示杂交信号时，首先将碱性磷酸酶标记的链霉亲和素与杂交体上的生物素结合，并使用硝基四氢呋喃。 NBT 和 5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸盐 (BCIP) 用作底物。将碱性磷酸酶展示在杂交体上（或使用ABC法将生物素展示在杂交体上）或用碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体与杂交体上的地高辛结合，并使用NBT和BCIP展示碱性磷酸酶，样本在进行放射自显影处理以揭示另一种目标核酸之前会被脱水和干燥。一步法的优点是杂交反应一步完成，操作过程短，同一细胞内的两个信号易于区分；缺点是放射自显影的阳性信号明显小于单一标记，并且碱性磷酸酶或ABC产物的阳性反应可能会导致核心乳胶的化学显影。在两步法中，两次杂交反应使用不同的探针。通常，首先使用35S标记的探针进行原位杂交。在通过放射自显影显示第一个杂交体后，使用生物素或地高辛标记的探针。将探针进行第二次原位杂交，按照生物素-亲和素-碱性磷酸酶法(或ABC法)或地高辛-抗地高辛抗体-碱性磷酸酶法展示第二次杂交体。 。两步法的杂交信号在显微镜下清晰可见。使用放射性核素标记探针进行首次原位杂交的整个操作流程，包括放射自显影和固定过程，不会改变mRNA的结构，也不会影响杂交过程中靶核酸与探针的配对。第二次杂交反应。的可访问性。两步法整个操作流程比一步法长，但没有一步法中放射性标记信号丢失的缺点，也没有碱性磷酸酶可能存在的缺点（或 ABC）可能导致乳胶化学反应的阳性反应产物。
(2)非放射性标记探针双标原位杂交
如果不同的核酸探针标记不同的标记，只要不影响彼此的杂交反应，检测系统互不干扰，杂交信号易于区分，原则上都可以用于双或多标记原位杂交。使用非放射性标记探针进行双标记原位杂交。它可以克服放射性核素标记探针分辨率低、时间长、放射性污染等缺点。
1．使用生物素和地高辛标记探针进行双标记原位杂交。当使用分别标记有生物素和地高辛的两个探针进行双标记原位杂交时，杂交反应可以使用含有两个标记探针的杂交液。一次性完成所有操作。因为生物素标记的探针可以用辣根过氧化物酶标记的亲和素检测（以3-氨基-9-乙基-咔唑为底物，阳性反应产物为红色），而地高辛标记的探针可以用辣根过氧化物酶标记的亲和素检测碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体（反应产物为蓝色）。两种检测系统互不干扰，因此标记的亲和素和抗地高辛抗体也可以一次混合在一起。孵化。但两种酶的显色反应需要相同的pH条件，因此显色反应需要进行两次。
2．双荧光标记原位杂交利用不同颜色的荧光团标记不同的核酸探针，可检测同一组织或细胞中两种不同的靶核酸。使用不同荧光团作为标记的双标记原位杂交有两种类型：直接法和间接法。直接法用两种不同颜色的荧光团标记两种不同的核酸探针，并将其用于原位杂交。通过选择不同的激发滤光片，可以在荧光显微镜下直接观察杂交信号。这种方法操作简单，但灵敏度不太高。间接法是利用生物素和地高辛分别标记两种不同的核酸探针，然后用不同的荧光素标记的亲和素（或抗生物素抗体）和抗地高辛抗体来检测杂交体。间接方法比直接方法更灵敏。
(3) 两个放射性核素标记探针的双标记原位杂交
分别用3H和35S标记两种不同的探针，并使用混合探针进行原位杂交。在放射自显影过程中，标本涂有两层核乳胶，并在两层之间用透明塑料膜隔开。由于3H的β射线能量较低，因此3H的信号在第一层乳胶上； 35S的β射线能量很高。它不仅可以露出第一层芯乳胶，还可以穿透塑料薄膜，露出第二层芯乳胶。结果，在两层芯乳胶中可以同时看到35S信号。使用彩色显微放射自显影技术，两层乳胶上的信号分别显示为深红色和蓝色。这两种杂交信号在显微镜下更容易识别。
该方法虽然可以检测同一标本上位于不同细胞的两个靶核酸，但无法区分位于同一细胞的两个靶核酸。而且该技术操作复杂，检测过程需要两次放射自显影，耗时较长，因此其推广和使用受到一定的限制。
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